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                  禽流感病毒H9亞型RT-PCR檢測試劑盒




                  產品編號:AP005


                  檢測方法:PCR 檢測


                  檢測樣品:血液,糞便或泄殖腔式子


                  規格:25T/50T




                    

                  禽流感病毒H9亞型RT-PCR檢測試劑盒




                  【產品名稱】

                  通用名稱:禽流感病毒H9亞型RT-PCR檢測試劑盒

                  英文名稱:Avian Influenza virus H9 hemagglutinin subtypes RT-PCR Detection Kit

                  【包裝規格】10頭份/ & 50頭份/

                  【預期用途】

                  本試劑盒適用于禽流感病毒檢測,定性檢測禽流感病毒H9亞型,對禽流感病毒引起的流感及其并發癥的診斷及療效評估有重要指導意義。

                  【檢驗原理】

                  利用離心柱內硅基質膜提取RNA,在反轉錄酶的作用下,以RNA為模板,以引物為起點合成與RNA模板互補的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下,經高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環,使特異DNA片段的拷貝數放大一倍。經過35次循環,最終使擴增DNA片段放大了數百萬倍。將擴增DNA片段進行電泳,經染色后,在紫外燈照射下,肉眼可見到DNA片段的擴增帶。

                  【主要組成成份】

                  組成

                  10頭份/

                  50頭份/

                  禽流感H9 RT-PCR反應液

                  150 μL×1

                  750 μL×1

                  禽流感H9 混合酶液

                  30 μL×1

                  150 μL×1

                  禽流感H9 陽性對照

                  40 μL×1

                  40 μL×1

                  禽流感H9 陰性對照

                  40 μL×1

                  40 μL×1

                  0.2 mL薄壁PCR

                  12

                  60

                  50TAE電泳緩沖液(50倍稀釋后使用)

                  20 ml

                  100 ml

                  染色液

                  20 μL

                  50 μL

                  上樣緩沖液

                  40 μL

                  200 μL

                  制備管

                  10

                  50

                  2 ml 離心管

                  20

                  100

                  1.5 ml 離心管

                  10

                  50

                  Buffer V-L(病毒裂解液)

                  2.4 ml

                  12 ml

                  Buffer V-N(蛋白去除液)

                  0.8 ml

                  4 ml

                  Buffer W1A concentrate(洗滌液)

                  4.8 ml

                  24 ml

                  Buffer W2 concentrate(去鹽液)

                  4.8 ml

                  24 ml

                  Buffer TEnuclease-free

                  0.8 ml

                  4 ml

                  說明書

                  1

                  1

                  注:陰性對照為禽類基因組DNA,陽性對照為失去活性的禽流感病毒H9亞型cDNA。

                  【儲存條件及有效期】-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。

                  【需自備的物品】

                  1.儀器:分析天平、離心機、PCR擴增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀(或紫外分析儀)、微波爐、-20 ℃冰箱、可調移液器(2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL)。

                  2.耗材:眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL量筒、500 mL錐形瓶、經焦碳酸二乙酯(DEPC)水處理的滅菌1.5mL離心管和吸頭(10 μL、200 μL、1000 μL)、滅菌雙蒸水。

                  【注意事項】

                  1.病毒具有很強的感染能力,操作前必須準備好各種防御措施。

                  2.操作時須嚴格按照步驟進行,廢物必須放入含消毒液的廢物缸,以免污染實驗室和工作人員。

                  3.為避免其他核酸的污染而出現假陽性,必須使用不含DNARNA的離心管、吸管、槍頭、試劑和手套,操作人員須戴口罩。

                  4.Buffer V-L、Buffer V-NBuffer W1A含刺激性化合物,操作時要戴乳膠手套和眼鏡,避免沾染皮膚、眼睛和衣服,謹防吸入口鼻。

                  【實驗準備】

                  第一次使用時,請在Buffer W1 ABuffer W2 concentrate中按試劑瓶上指定的體積加入無水乙醇;

                  準備異丙醇(1%冰乙酸):即99ml異丙醇中加入1ml冰乙酸,混合均勻,室溫密閉儲存;

                  如果是提取病毒RNA,請選用RNase free Tip槍頭和1.5 ml離心管或將槍頭和離心管用0.1% DEPC水處理后再使用。

                  【操作步驟】

                  1.樣品處理:每份樣品分別處理。

                  1)無細胞體液樣品處理:收集200 μL樣品,轉入到1.5 ml離心管中;

                  2)全血樣品處理:待血凝后取血清 200 μL , 轉入到1.5 ml離心管中;

                  3)組織樣品處理:每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g ,用手術剪碎混勻后取 ,用手術剪碎混勻后取 0.05 g于研磨器中,加入1.5 mL生理鹽水繼續充分研磨,待勻漿后轉至1.5 mL 滅菌離心管中,12,000 rpm離心 5 min,取上清液 200 μL 1.5 mL離心管中。

                  2. 提取過程:

                  1)向上一步轉入樣品的1.5 mL的離心管中,加入200 μL Buffer V-L,渦旋振蕩混合均勻,靜置5 min。

                  2)加入75 μL Buffer V-N,渦旋振蕩混合均勻后,于12,000 rpm離心5 min。

                  3)將上清液轉移到新的2mL離心管(試劑盒內已提供)中,加300 μL異丙醇(1%冰乙酸),上下倒置6-8次,混合均勻。

                  4)將制備管置于2ml離心管(試劑盒內提供)中,取上一步驟中的混合液移入制備管中,6,000 rpm離心1 min。

                  5)棄濾液,將制備管放回到2 ml離心管中,加入500 μL Buffer W1A(確認已按要求加入無水乙醇),室溫靜置1min,于12,000rpm離心1 min。

                  6)棄濾液,將制備管放回到2 ml離心管中,加入800 μL Buffer W2(確認已按要求加入無水乙醇),于12,000 rpm離心1 min。

                  7)將制備管放回到2 ml離心管中,12,000 rpm離心1 min。

                  8)將制備管置于潔凈的1.5 ml離心管(試劑盒內已提供)中,在制備管膜中央加入40-60 μL Buffer TEnuclease-free),室溫靜置1min,于12,000rpm離心1-2min洗脫DNA/RNA。

                  注:洗脫體積越大,洗脫效率越高。如果需要DNA/RNA濃度較高,可以將洗脫的DNA/RNA再次過柱離心洗脫一次;或適當減少洗脫體積, 但是最小體積不應少于30 μl,體積過小降低洗脫效率,減少RNA產量。

                  3. RT-PCR擴增

                  每份總體積20 μL,含15 μL RT-PCR反應液(用前混勻),3μL 混合酶液,2 μL模板RNA。

                  例如:n份樣品,配制n+1份,15×(n+1RT-PCR反應液, 3×(n+1)混合酶液勻后取18 μL分裝成n份,分別加入2 μL模板RNA,作好標記。

                  PCR擴增儀上進行以下程序:50  10 min,94  3 min;循環94 30 s,55  30 s,72  30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min。

                  4. 電泳

                  1.5 g瓊脂糖放于500 mL錐形瓶中,加入50倍稀釋的TAE電泳緩沖液100 mL(取2 mL 50TAE電泳緩沖液,用雙蒸水稀釋至100 mL),于微波爐中熔解,再加入50 μL染色液混勻。在電泳槽內放好梳子,倒入瓊脂糖凝膠,待凝固后將PCR擴增產物10 μL點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以110120V電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳,紫外燈下觀察結果。

                  【結果判定】

                  陽性對照出現198 bp擴增帶、陰性對照無帶出現(引物帶除外)時,實驗結果成立。被檢樣品出現198 bp擴增帶為禽流感病毒H9亞型陽性,否則為陰性。

                   


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